TRANSFERTS DE GÈNES ET TRANSGÉNOSE

TRANSFERTS DE GÈNES ET TRANSGÉNOSE

Tout organisme, animal ou végétal, comporte une information dite génétique contenue dans des molécules d’acide désoxyribonucléique (ADN) ou ribonucléique (ARN). Cette information est transmise aux descendants et assure normalement, via les acides nucléiques et les protéines dont elle permet la synthèse, le développement correct de l’organisme. Les gènes qui composent cette structure informative sont nombreux et le moyen classique de connaître leur rôle est l’étude des conséquences de leur inactivation par mutation.

Chez les organismes inférieurs, la création de mutants a été largement utilisée dans cet objectif. Chez les eucaryotes supérieurs, la durée des générations, le caractère sexué de la reproduction, la complexité des structures et des fonctions, le nombre restreint de conditions permettant de sélectionner des mutants rendent plus difficile la découverte du rôle de chaque gène.

La possibilité d’introduire un gène particulier, dans divers types cellulaires en culture, a considérablement ouvert le champ des connaissances concernant la fonction et les séquences impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. C’est ainsi que le caractère oncogénique de divers gènes a pu être démontré. Ces études dites ex vivo sont limitées, entre autres, par l’impossibilité de maintenir en culture certaines cellules, d’étudier les régulations résultant de l’interaction entre divers types cellulaires telles qu’elles peuvent se produire in vivo, comme d’analyser la régulation de l’expression des gènes au cours du développement.

La possibilité d’introduire très précocement un gène normal ou muté dans un organisme étranger permet d’aborder toutes ces questions. En outre, le fait de pouvoir introduire un gène dans un organisme avec, pour conséquence, une modification stable de son génotype autorise des modifications particulièrement intéressantes aussi bien de végétaux que de certaines espèces animales. Des plantes résistantes aux herbicides ou ayant acquis des propriétés nutritives plus importantes pourraient être obtenues. Des espèces animales adaptées à la vie dans des zones arides et produisant un lait de qualité médiocre pourraient être transformées en espèces productrices de lait hautement nutritif. Si l’on ajoute qu’il est aujourd’hui possible non seulement d’ajouter un gène étranger au génome d’un organisme, mais encore de remplacer exactement un gène par une séquence homologue qui n’en diffère que par quelques bases, on conçoit qu’il soit possible de créer à volonté des mutations ou au contraire de remplacer un gène muté par un gène normal.

Les techniques de transfert de gènes dans les organismes, qu’il s’agisse d’animaux ou de végétaux, sont massivement employées, et cela dans des domaines extrêmement variés allant de l’amélioration des espèces à la création de modèles animaux de maladies humaines, de la production de molécules d’intérêt thérapeutique à la compréhension de mécanismes biologiques complexes: oncogenèse, mise en place du système immunitaire, différenciation, développement...

Il s’agit à n’en point douter d’une avancée technologique considérable capable d’une part de faire progresser rapidement la génétique des mammifères, d’autre part de permettre l’alliance délicate des exigences de production des substances alimentaires et de protection de l’environnement.

1. Les animaux transgéniques

Un animal est dit transgénique lorsqu’il possède, outre les séquences d’acide désoxyribonucléique (ADN) qui constituent son génome, des gènes supplémentaires ou «transgènes» qui ont été ajoutés à son patrimoine héréditaire. L’introduction, à volonté, de tel ou tel gène dans la lignée germinale des mammifères (il s’agit le plus souvent de souris) constitue l’une des techniques les plus performantes de la biologie. Il devient possible de créer des modèles animaux de diverses maladies provoquées chez l’homme par l’expression qualitativement ou quantitativement anormale d’un gène, modèles dont l’intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d’éventuelles thérapeutiques apparaît à l’évidence. Des mécanismes complexes – mise en place du système immunitaire, mécanisme d’action des oncogènes... – qui font intervenir de multiples régulations et interactions cellulaires deviennent, par la technologie des animaux transgéniques, accessibles à l’analyse. Par ailleurs, la production massive de protéines, qui nécessitent, pour être actives, des transformations variées que ne peuvent effectuer que les eucaryotes supérieurs, est rendue possible.

Obtention des souris transgéniques

Les souris transgéniques sont obtenues par trois modalités opératoires. La micro-injection de gènes clonés dans l’œuf de souris est réalisée, avant la fusion des noyaux d’origine paternelle et maternelle, dans celui des deux noyaux qui est le plus accessible et le plus gros, à savoir (le plus souvent) le pronucleus mâle. Cela est effectué sous microscope à l’aide de deux micromanipulateurs ; l’un permet d’immobiliser l’œuf par légère aspiration à l’extrémité d’une pipette et l’autre permet d’injecter l’ADN (fig. 1). Les œufs sont ensuite réimplantés dans l’utérus de femelles préalablement accouplées avec des mâles vasectomisés. Ces femelles, dites pseudogestantes, se trouvent ou ont été mises dans un état hormonal permettant l’implantation et le développement des embryons. Environ de 20 à 30 p. 100 des souriceaux obtenus ont intégré dans leurs chromosomes l’ADN injecté et sont dits transgéniques (fig. 2). Le mécanisme par lequel l’ADN s’intègre dans les chromosomes n’est pas connu, mais par cette technique on le retrouve le plus souvent à raison de plusieurs copies intégrées en tandem tête à queue (l’extrémité droite d’une copie est suivie de l’extrémité gauche de la suivante), en un site unique ou en un nombre réduit de sites. Aucune spécificité quant à ces sites d’intégrations n’a, à ce jour, été détectée. Les nombreux réarrangements qui ont lieu lors de l’intégration rendent d’ailleurs difficiles le clonage et l’analyse des sites d’intégration. L’avantage de cette méthode est l’obtention d’un pourcentage élevé de lignées transgéniques qui expriment les gènes introduits de façon prévisible d’après les séquences régulatrices qui gouvernent leur expression.

Une autre technique (fig. 2) consiste à infecter des embryons à l’aide de rétrovirus, mettant à profit leur capacité à s’intégrer dans le génome des cellules infectées. Dans une première étape, la séquence à introduire est intégrée dans le génome viral, puis les embryons sont mis en présence de virus recombinants. Le principal avantage de cette méthode est la possibilité d’introduire le virus à différents stades au cours du développement embryonnaire, permettant l’obtention d’animaux chimériques dans lesquels seules les cellules issues de celles qui ont été infectées portent le transgène. Le second avantage résulte du mode d’intégration de l’ADN rétroviral: le transgène n’est présent qu’à raison d’une copie par cellule et les sites d’intégration ne sont pas bouleversés. Il existe, en revanche, deux inconvénients majeurs: la taille des fragments que l’on peut insérer dans un virus est limitée; l’expression des transgènes n’est pas aussi reproductible qu’avec la méthode précédente.

La troisième technique utilise comme cellule hôte des cellules souches embryonnaires prélevées dans un blastocyste, c’est-à-dire un embryon non implanté âgé de quatre jours et demi. Ces cellules peuvent être maintenues en culture, infectées à l’aide de rétrovirus recombinants ou micro-injectées, puis être réintroduites dans la cavité d’un blastocyste. Après réimplantation, un souriceau mosaïque se développera, dans lequel toutes les cellules issues des cellules souches infectées porteront le trangène. Le principal avantage de cette technique est qu’une sélection des cellules souches exprimant le transgène est possible. Elle permet aussi la sélection ou la reconnaissance des cellules dans lesquelles le remplacement du gène endogène par le transgène homologue a eu lieu. Seules ces cellules seront alors réimplantées dans le blastocyste, ouvrant le champ à la création de modèles animaux de diverses mutations ou, à l’inverse, à leur correction.

D’autres animaux transgéniques ont pu être obtenus. Les techniques sont assez proches de celles qui sont décrites pour obtenir des souris transgéniques. Les embryons de certaines espèces – porcine en particulier – ayant des noyaux peu visibles, il est parfois nécessaire d’effectuer, avant micro-injection, des étapes (centrifugation par exemple) permettant de mieux les distinguer au sein du cytoplasme. Chez le poulet, les premiers résultats obtenus par infection de l’embryon, à l’aide de virus recombinants, défectifs pour la réplication, ont été rapportés. Les virus non défectifs précédemment utilisés limitaient l’utilisation des poulets transgéniques, en particulier dans le domaine agroalimentaire.

Le transfert de gène chez la drosophile, ou mouche du vinaigre, très utilisée par les généticiens, est particulier. Au sein du génome des eucaryotes comme des procaryotes, certaines séquences ont la capacité de se déplacer d’un site à un autre du génome et sont de ce fait appelés éléments transposables ou transposons. Chez la drosophile, les éléments P appartiennent à cette catégorie de séquences. Ils codent pour une transposase et possèdent à leurs extrémités des séquences nécessaires à leur intégration dans le génome. Si l’on injecte simultanément dans des embryons un élément P portant le gène à introduire à la place de la transposase et un élément P intact, la transposase codée par ce dernier va reconnaître, outre les extrémités de l’élément P intact, celles de l’élément P recombiné et permettre l’insertion de ce dernier dans le génome. La mouche transgénique obtenue porte habituellement une seule copie du transgène qui, de plus, est correctement exprimée au cours du développement. Les rendements d’intégration d’un transgène entouré des extrémités d’un élément P, catalysés par la transposase, sont très élevés.

Applications de la technologie des souris transgéniques

Étude de la régulation de l’expression des gènes

La régulation de l’expression des gènes, soit au cours du développement, soit sous l’influence de facteurs hormonaux ou nutritionnels, s’effectue en partie au niveau transcriptionnel, c’est-à-dire lors de l’étape de synthèse des ARN messagers, molécules intermédiaires entre le gène et la protéine. Des séquences du gène ou qui lui sont contiguës sont impliquées dans cette régulation et constituent des cibles des facteurs de régulation. Déterminer quelles sont ces séquences, et en particulier celles qui règlent l’apparition de l’expression d’un gène dans un tissu donné au cours du développement, est d’une importance capitale et ne peut être parfaitement réalisé sur modèle cellulaire. En revanche, l’introduction de gènes présentant des délétions plus ou moins importantes des séquences non codantes, dans des embryons de souris, peut permettre d’élucider ce problème. Ainsi, des délétions successives des séquences bordantes en 5 des gènes de l’élastase, de la cristalline ou encore de la protamine ont permis d’affirmer que quelques centaines de bases sont suffisantes pour que l’expression de ces gènes s’effectue correctement dans, respectivement, le pancréas, le cristallin et les spermatozoïdes, tissus où sont normalement trouvées les protéines dont ils dirigent la synthèse. Pour d’autres gènes (albumine, alpha fœtoprotéine...), des séquences situées à plus de 45 000 bases en amont des séquences codantes sont nécessaires à la régulation. Pour d’autres encore ( 廓 globine...), des séquences en aval ou situées entre les séquences codantes (introns) sont aussi nécessaires à certains types de régulation. Ainsi, le nombre et le positionnement des séquences régulatrices sont extrêmement variables suivant les gènes, mais il apparaît clairement que l’expression d’un gène, entouré de celles-ci, ne nécessite pas qu’il soit positionné, à sa place, dans le génome. En d’autres termes, un gène muni de ses séquences régulatrices et intégré sur l’un quelconque des chromosomes est capable de s’exprimer correctement. Lorsque toutes les séquences régulatrices ne sont pas présentes ou bien lorsque leur action est faible, l’expression du transgène peut cependant être influencée par le site d’intégration. De telles séquences, comportant un promoteur faible, ont été utilisées pour repérer des sites actifs dans le génome. Lorsque le transgène, à lui seul faiblement actif, s’intègre dans ces régions, une expression pourra être détectée dans tel ou tel tissu de l’organisme. Les sites d’intégration, supposés être activateurs, peuvent alors être clonés et caractérisés. À l’inverse, l’intégration d’un transgène dans certaines parties du génome peut en empêcher l’expression. Il existe en effet dans le génome des régions constituées d’hétérochromatine dans lesquelles les séquences d’ADN ne sont pas exprimées. Il semble qu’un transgène intégré dans ces régions puisse subir des modifications, par exemple des méthylations ou des changements conformationnels induits par les séquences environnantes, empêchant son expression. Comme les précédentes, ces séquences muettes du génome peuvent être caractérisées. Enfin, l’introduction de séquences chimériques (constructions comportant des séquences régulatrices A mises en amont d’un gène B) a permis de mettre en évidence qu’une même séquence activatrice («enhancer») peut entraîner l’expression de certains gènes dans le tissu attendu, alors que d’autres gènes seront, sous son contrôle, exprimés dans des tissus différents, suggérant l’existence dans la séquence B de séquences régulatrices interférant avec le enhancer A utilisé.

Modèles d’oncogenèse

L’utilisation de divers promoteurs et séquences régulatrices pour gouverner l’expression d’oncogènes ou de proto-oncogènes permet d’obtenir des animaux transgéniques qui expriment tel ou tel oncogène dans tel ou tel tissu. Il devient alors possible de tester l’effet de l’expression d’un oncogène donné dans divers types cellulaires et de divers oncogènes dans un même tissu. De plus, par croisement entre des souris portant des transgènes différents, la coopération entre oncogènes peut être analysée. Un grand nombre de modèles ont été obtenus, parmi lesquels il faut citer des tumeurs du pancréas exocrines et endocrines, des tumeurs du cristallin, de la peau ou des glandes mammaires, des tumeurs cardiaques, des lymphomes, etc. Dans la plupart des cas, seules quelques cellules parmi celles qui expriment l’oncogène acquièrent un phénotype transformé , et cela avec un délai d’apparition par rapport au début de l’expression de l’oncogène. Des événements ultérieurs sont donc nécessaires à la transformation tumorale, l’expression de l’oncogène n’étant qu’un des éléments de la cascade des événements en cause (fig. 3).

Un second événement peut être, par exemple, l’expression d’un autre oncogène. Ainsi, la co-expression des oncogènes ras et myc , dans la glande mammaire par exemple, provoque une transformation plus précoce que celle qu’induit l’expression de l’un ou l’autre de ces oncogènes.

D’autre part, il a été démontré que, selon le niveau d’expression conféré par le promoteur utilisé, une transformation plus ou moins précoce d’un même tissu peut être obtenue. Enfin, un même niveau d’expression du même oncogène conduit ou non, selon les tissus, à une transformation. Outre ce qu’apportent ces modèles à la compréhension des mécanismes de l’oncogenèse, ils peuvent être utilisés pour réaliser des essais thérapeutiques. Enfin, la mise en culture de multiples types cellulaires prélevés sur des souris transgéniques exprimant des oncogènes variés devrait permettre d’obtenir des modèles cellulaires alliant un état de différenciation conservé à la capacité de se multiplier aisément in vitro.

Perspectives de thérapie génique

Le fait qu’il soit possible, chez l’animal, de corriger une maladie héréditaire par transfert du gène normal dans les embryons déficitaires, c’est-à-dire d’ajouter à un génome, dont le gène A est muté, le gène A normal, peut aujourd’hui être considéré comme acquis. Le premier exemple fut la correction du nanisme chez les souris portant la mutation little . Chez ces souris, il existe un défaut des récepteurs au facteur stimulant la synthèse d’hormone de croissance. Des embryons de souris mutés furent injectés avec une séquence d’ADN comportant le gène de l’hormone de croissance de rat. L’expression de cette séquence, chez les souris transgéniques obtenues, provoque une élévation de l’hormone de croissance circulante et une normalisation de la croissance. D’autres anomalies héréditaires murines (mutation de l’hémoglobine, déficit enzymatique – fig. 4 –, etc.) furent ensuite corrigées par la même méthode.

Dans les exemples cités ci-dessus, le gène muté n’est pas remplacé par le gène normal, ce dernier étant simplement ajouté au génome. Il est en réalité aujourd’hui possible de remplacer exactement le gène muté par le gène normal par un mécanisme de recombinaison homologue. Ces événements de recombinaison homologue sont moins probables que ne l’est l’intégration au hasard dans le génome, mais il est possible de sélectionner ou de reconnaître les cellules dans lesquelles ils se sont produits. Intéressante dans le cadre d’une thérapie génique germinale, la recombinaison homologue est aussi essentielle, comme nous le verrons, pour la création de modèles animaux de certaines maladies.

L’intérêt des thérapies géniques germinales n’est, en aucune façon, de constituer un préalable à de telles manipulations chez l’homme. En effet, des raisons aussi bien techniques qu’éthiques empêchent tout à fait de les envisager. Ces expériences permettent en revanche de démontrer qu’une mutation est bien à l’origine du phénotype observé chez le mutant et de savoir dans quel tissu il est nécessaire que s’exprime le gène normal pour obtenir une correction du déficit. Ces éléments peuvent être utiles à la mise au point de thérapies géniques somatiques (introduction d’un gène dans des cellules en culture et réintroduction de ces cellules dans l’organisme), dont l’applicabilité à l’espèce humaine est, quant à elle, tout à fait envisageable.

Souris transgéniques et immunologie

L’un des premiers apports de la technologie des souris transgéniques à l’immunologie concerne le mécanisme de l’exclusion allélique. La synthèse des immunoglobulines nécessite un réarrangement génique qui est à la base de la diversité de la réponse immunitaire. Ce réarrangement ne se produit que sur l’un des deux allèles présents dans un lymphocyte, phénomène connu sous le nom d’exclusion allélique. L’introduction dans la lignée germinale d’un gène réarrangé a permis, d’une part, de montrer qu’il pouvait être activé de façon normale et, d’autre part, d’affirmer que son expression perturbait l’expression des gènes endogènes. Lorsque le transgène réarrangé est exprimé à un niveau élevé, une inhibition du réarrangement des allèles endogènes se produit, permettant de suggérer qu’un mécanisme de rétro-contrôle par les immunoglobulines synthétisées, et plus précisément par leur forme membranaire, serait à l’origine de l’exclusion allélique.

La possibilité de modifier le système du complexe majeur d’histocompatibilité, responsable en particulier du rejet de greffe, et de provoquer l’expression d’antigènes artificiels devrait permettre par ailleurs d’analyser les phénomènes complexes de l’immunité cellulaire.

Les mécanismes de l’auto-immunité, encore mal connus, commencent aussi d’être éclairés par cette technologie. Les transgènes, intégrés dès les premiers stades du développement, sont considérés comme des gènes de l’hôte, et leur produit fait l’objet d’une tolérance immunitaire identique à celle qu’on observe pour les protéines endogènes. Dans un cas, cependant, des anticorps dirigés contre la protéine codée par le transgène apparurent, signant un mécanisme de type auto-immun. Cette apparition fut corrélée à une expression tardive du transgène. Cela suggère qu’un simple retard dans l’apparition d’une protéine à la surface d’une cellule peut entraîner l’absence d’établissement d’une tolérance immunologique. Un tel phénomène pourrait être à l’origine de certains diabètes insulino-dépendants dans lesquels apparaissent des anticorps dirigés contre une protéine présente à la surface des cellules bêta du pancréas.

Mise au point de modèles animaux de maladies

Diverses lignées de souris mutantes ont des phénotypes qui sont proches de certaines maladies humaines. Cependant, le gène touché n’est le plus souvent pas identifié, et il est rare que ces souris constituent de réels modèles animaux des maladies humaines. On peut obtenir de tels modèles en sélectionnant des cellules embryonnaires mutées pour une fonction particulière et en les réintroduisant dans la cavité d’un blastocyste (embryon de 4,5 jours). Dans un certain nombre de cas, les cellules de la lignée germinale des souris chimériques obtenues porteront le gène muté. Cela permet de créer, lorsqu’un mode de sélection est possible, des lignées de souris portant une mutation particulière. Dans le cas de la maladie de Lesh-Nyhan, maladie neurologique liée au déficit enzymatique en hypoxanthine phosphorybosyl transférase (HPRT), le modèle obtenu ainsi fut décevant en ce sens que le déficit en HPRT chez la souris n’a pas les conséquences dramatiques qu’il a chez l’homme. Un tel résultat n’infirme cependant pas les perspectives très encourageantes pour la production d’autres modèles.

Une autre méthode consiste à introduire une séquence d’ADN capable d’empêcher l’expression normale d’un gène. Dans le cas de protéines multimériques, on peut introduire un gène codant pour un peptide muté qui, associé aux peptides endogènes, formera un polypeptide inactif. Une mutation ponctuelle du gène codant pour l’une des chaînes du collagène, observée chez des patients atteints d’une maladie létale dominante (osteogenesis imperfecta ), fut ainsi introduite dans le gène normal. Ce gène artificiellement muté fut micro-injecté dans des embryons de souris normales. Les souris transgéniques qui expriment ce transgène meurent en période périnatale reproduisant le phénotype humain précédemment décrit, ce qui confirme que cette mutation est bien à l’origine de la maladie.

Des modèles de déficits enzymatiques peuvent aussi être obtenus par introduction de séquences codant pour des ARN messagers complémentaires (ARN messagers antisens) d’une séquence endogène donnée. Cette complémentarité doit entraîner l’appariement entre ces chaînes d’acides nucléiques. Ainsi l’ARN messager endogène ne se trouverait plus disponible pour gouverner la synthèse de la protéine pour laquelle il code. Une telle méthode a permis d’obtenir une copie phénotypique d’une maladie neurologique de la souris: la tremblante, ou shiverer en anglais. La mutation shiverer touche une protéine localisée autour des fibres nerveuses (la protéine basique de la myéline). Cela fut démontré grâce à la technologie des souris transgéniques par correction génique du phénotype shiverer par micro-injection du gène codant pour la protéine normale. À l’inverse, la micro-injection, dans des embryons normaux, d’une séquence codant pour un ARN messager antisens capable de s’hybrider au messager endogène a permis d’obtenir une forte diminution de l’expression de la protéine et l’apparition du phénotype shiverer. La limite actuelle d’une telle méthode réside dans la difficulté de diminuer suffisamment la synthèse de la protéine endogène pour qu’apparaisse le phénotype muté. La production massive, grâce à l’utilisation de promoteurs adaptés, d’ARN antisens très stables devrait permettre d’utiliser cette puissante technique pour la création de nombreux modèles animaux de maladies humaines.

Des modèles de surexpression génique (surexpression de la superoxyde dismutase permettant de connaître le rôle de cette expression dans le phénotype des trisomiques 21 par exemple) ou d’expression anormale d’un gène dans un tissu donné ont aussi été obtenus. Ainsi, des modèles de diabètes ont été créés par production de souris transgéniques exprimant des molécules de classe II à la surface des cellules B du pancréas. La présence de telles molécules est détectée dans les diabètes humains insulino-dépendants. L’analyse des souris transgéniques a permis d’éliminer l’hypothèse selon laquelle l’expression dans les cellules B des molécules de classe II pourrait, quel que soit le stade ontogénique où elle se produit, déclencher la réaction auto-immune caractéristique de ce type de diabète chez l’homme. En revanche, ils mettent en évidence leur intervention directe dans la perturbation de la production d’insuline et probablement leur rôle dans la réaction auto-immune lorsque leur expression est tardive ou lorsque leur présence autorise la présentation de peptides produits tardivement au cours de l’ontogenèse.

Des modèles de maladie virale, ou plus exactement des informations précises sur l’origine des troubles observés lors d’une infection virale, peuvent être obtenus. Il est par exemple possible de distinguer les effets directement provoqués par l’expression des protéines codées par le virus – protéines qui, chez les souris transgéniques qui les expriment, seront considérées comme appartenant au «soi», et donc tolérées par le système immunitaire – des effets liés à la réaction immunitaire de l’hôte en réponse à l’infection virale. Il est aussi envisageable de faire s’exprimer diverses protéines humaines à la surface des cellules d’une souris, la rendant ainsi permissive à l’infection par un virus humain, créant de ce fait des modèles murins d’infections virales humaines.

Enfin, des mutations au hasard peuvent être créées à l’endroit où s’intègre le transgène dans le génome. Cette mutagenèse dite insertionnelle sera développée dans le paragraphe relatif au développement.

Enfin, le champ des modèles qu’il est possible de produire s’est aujourd’hui considérablement élargi grâce à la maîtrise des recombinaisons homologues qui permettent de remplacer très exactement un gène normal par un gène muté.

Problème des empreintes parentales, et méthylation de l’ADN

Le mode de transmission de certaines maladies (certaines formes de myotonies musculaires, de maladie de Huntington ou l’apparition des moles hydatiformes...) se fait par le père ou par la mère alors que le gène affecté ne se trouve pas sur un chromosome sexuel mais sur un autosome. L’origine de ce phénomène peut résider dans l’existence de plusieurs gènes responsables de la production d’une protéine, l’un d’entre eux, dont la mutation conduit aux formes classiques de la maladie avec une transmission sur un mode autosomique, se trouvant sur un autosome, l’autre, localisé sur un chromosome sexuel, étant muté dans les formes dont la transmission ne se fait que par l’un des parents. Une autre hypothèse est que certains gènes subissent des modifications différentes (méthylation et/ou changements conformationnels) selon qu’ils se trouvent dans les gamètes femelles ou les gamètes mâles. Ces modifications entraîneraient l’expression ou la non-expression du gène selon qu’il est transmis par le père ou par la mère. L’existence de ce type de modification, dite empreinte parentale (ou encore sceau génomique parental) a été démontrée par la technologie des souris transgéniques. Cela expliquerait le type de transmission des maladies dont il a été question dans ce paragraphe.

Identification de la filiation cellulaire

Connaître le destin des cellules issues de la division d’une cellule souche au cours du développement des organismes supérieurs est d’une importance capitale pour la compréhension des mécanismes de différenciation. Les étapes qui précèdent l’implantation de l’embryon sont accessibles à l’observation; en revanche, celles qui sont postérieures ne permettent pas l’utilisation des traceurs usuels et nécessitent des marqueurs stables qui n’interfèrent pas avec le développement. L’introduction d’un gène dans une fraction des cellules d’un embryon peut être obtenue par deux techniques précédemment décrites, à savoir l’infection d’embryons par des rétrovirus recombinants et l’introduction d’ADN dans les cellules embryonnaires. Les souris transgéniques obtenues sont chimériques, c’est-à-dire que les cellules issues des divisions successives des cellules embryonnaires qui avaient incorporé le transgène possèdent ce marqueur, alors que les autres ne le contiennent pas. La répartition de ces deux types cellulaires permet d’éclairer la façon dont sont programmées les cellules au cours du développement. Le gène utilisé comme marqueur peut être choisi pour sa capacité à coder pour une protéine dont l’activité est aisément détectable (gène LacZ, par exemple, qui code pour la 廓 galactosidase dont l’activité peut être détectée par l’apparition d’une coloration bleue) ou encore ce peut être un gène codant pour une protéine toxique (toxine diphtérique par exemple) capable de tuer les cellules dans lesquelles il s’exprime. Un tel gène placé sous le contrôle d’une séquence régulatrice spécifique d’un type cellulaire particulier entraînera la disparition de toutes les cellules exprimant ce gène et de tous les types cellulaires dont le développement dépend des cellules détruites.

Cartographie des chromosomes

L’analyse de l’organisation des gènes sur les chromosomes se fait de proche en proche à partir de marqueurs connus. Il existe des régions chromosomiques riches en régions très répétitives et pour lesquelles aucun marqueur n’est connu. Si un transgène s’intègre dans ces régions, il constitue un marqueur chromosomique de ces régions. Ainsi, un transgène inséré dans une région dite pseudo-autosomale des chromosomes sexuels de souris (région ainsi dénommée car elle est présente sur les chromosomes X et Y) a permis de démontrer que, dans cette région d’appariement entre les chromosomes sexuels, de nombreux réarrangements par crossing-over se produisent (échanges par crossing-over couramment observés entre autosomes homologues). L’insertion de plus ou moins longues séquences dans le chromosome X a aussi permis d’affirmer que, en fonction de sa longueur, une séquence est ou non inactivée chez la femelle, suggérant que l’action d’un centre d’inactivation ne peut s’étendre sur de longues distances et que probablement plusieurs centres d’inactivation sont présents sur le chromosome X et conduisent chez la femelle à la non-expression de la plupart des gènes de l’un des deux chromosomes X (phénomène décrit sous le nom d’inactivation du chromosome X ou de «lyonisation», d’après le nom du chercheur Mary Lyon qui le mit en évidence). Enfin, comme nous l’avons évoqué précédemment, l’influence des sites d’intégration sur un transgène donné (extinction ou activation) peut permettre de caractériser des secteurs chromosomiques actifs ou inactifs, le transgène étant alors utilisé comme révélateur et comme sonde permettant de repérer le site d’intégration dans le génome.

Études relatives au développement

Comme nous l’avons déjà mentionné dans le paragraphe consacré à la régulation de l’expression des gènes, les souris transgéniques permettent de déterminer quelles sont les séquences nécessaires à la régulation de l’expression d’un gène au cours du développement. Il est aussi possible d’analyser les conséquences de l’expression qualitativement ou quantitativement anormale d’un gène que l’on sait être important dans telle ou telle étape du développement. Le rôle de certains proto-oncogènes a ainsi été analysé. Une dérégulation de l’expression du gène c-fos par exemple entraîne des anomalies très précoces du développement des os. L’expression du gène raf dans des lymphocytes de souris transgéniques exprimant myc les transforme en cellules myéloïdes suggérant le rôle des proto-oncogènes cellulaires dans la programmation des types cellulaires au cours de la différenciation.

Une autre approche repose directement sur l’une des imperfections de la technologie des souris transgéniques, à savoir l’absence de contrôle du site d’intégration. Cette intégration au hasard peut se faire dans un gène actif. Ce type d’événement, appelé mutagenèse insertionnelle puisqu’il s’agit d’une mutation occasionnée par l’insertion d’un ADN dans le génome de l’hôte, peut permettre de découvrir des gènes non encore identifiés, intervenant par exemple dans le développement. L’analyse de ces gènes est relativement simple lorsque la méthode utilisée pour obtenir des souris transgéniques est l’infection rétrovirale. En effet, par cette méthode, il n’y a pas de profond bouleversement au niveau du site d’intégration, et la séquence dans laquelle s’est insérée le transgène pourra être clonée, séquencée, et donc identifiée. La première mutagenèse insertionnelle ayant conduit à l’identification du gène atteint fut obtenue en 1983. Le génome viral s’était intégré dans le gène codant pour l’une des chaînes du collagène, entraînant chez les homozygotes, pour le transgène, la mort de l’embryon par rupture des vaisseaux sanguins. D’autres types de mutations ont été obtenus entraînant par exemple des malformations des membres, mais les gènes mutés n’ont pu être identifiés.

Autres animaux transgéniques

Vertébrés (moutons, porcs, lapins, poulets, truites)

Des gènes ont été injectés dans des embryons de multiples espèces – mouton, lapin, porc, poulet, etc. Des problèmes techniques, liés en particulier à la difficulté de bien voir les noyaux, font que les rendements sont en général largement inférieurs à ceux qu’on obtient avec les embryons de souris.

Les applications sont essentiellement agro-alimentaires, à savoir, d’une part, l’amélioration des espèces et, d’autre part, la production de molécules d’intérêt thérapeutique ou biologique. Chez les eucaryotes supérieurs, un certain nombre de protéines doivent subir, après qu’elles ont été synthétisées, des modifications importantes (glycosylation, clivage protéolytique, phosphorylations...) pour adopter leur conformation terminale et devenir actives. Désormais, on sait utiliser la machinerie bactérienne pour produire en grande quantité des protéines. Mais les bactéries ne peuvent correctement effectuer toutes les étapes de maturation des protéines eucaryotes. En revanche, ces étapes peuvent être réalisées dans certaines cellules en culture, mais la production massive reste impossible et les modèles cellulaires adaptés sont peu nombreux. La solution est alors de réaliser un animal transgénique dont le transgène comprend la séquence codant pour la protéine précédée de séquences régulatrices et capable de cibler l’expression dans le type cellulaire qui permet la maturation de la protéine. Il est parfois possible, et cela est important pour la production massive, d’ajouter au gène introduit une séquence codant pour un signal de sécrétion de la protéine dans le sang ou dans le lait, par exemple, rendant sa purification ultérieure plus aisée. Un facteur IX actif et de l’alpha I antitrypsine ont ainsi pu être produits.

Il est clair que l’obtention d’animaux dont les constituants seraient d’une qualité nutritionnelle plus importante (modification de la composition du lait par exemple) ou permettant de produire en grande quantité des protéines d’intérêt thérapeutique ou biologique est d’une grande utilité.

Drosophiles

Les mouches du vinaigre (Drosophila ) transgéniques sont principalement utilisées pour étudier le rôle de certains gènes dans le développement ou confirmer les effets de certaines mutations. Les séquences introduites portent, outre le gène choisi, des séquences d’ADN (éléments P) capables d’être reconnues par une enzyme (elle-même codée par un élément P) impliquée dans la transposition d’ADN d’un point à un autre du génome et favorisant donc l’intégration du transgène. Ces séquences n’interfèrent pas avec l’expression des transgènes qui répondent habituellement aux régulations agissant sur les gènes endogènes correspondants.

2. Les plantes transgéniques

Obtention de plantes transgéniques

Des plantes transgéniques sont naturellement produites par l’action d’une bactérie – Agrobacterium tumefaciens – qui contient un plasmide porteur de gènes capables d’induire des tumeurs dites «galle du collet» et capables de s’intégrer dans le génome des plantes. En remplaçant les gènes capables de provoquer la tumeur par le gène que l’on désire introduire dans une plante, on transforme le plasmide bactérien en un vecteur permettant le transfert de gènes dans les espèces végétales qui peuvent être infectées par Agrobacterium . Des plantes transgéniques furent d’abord obtenues par infection de protoplastes (cellules isolées dépourvues de paroi cellulaire) suivie de régénération à partir de ces protoplastes. Cette technique longue, limitée aux plantes capables de régénérer à partir de protoplastes, est aujourd’hui largement remplacée par celle qui consiste à découper de petits disques dans les feuilles et à les infecter par Agrobacterium contenant le plasmide recombiné porteur du gène à introduire. Placés sur des milieux adaptés, ces petits disques régénèrent, des racines poussent et une plante transgénique est obtenue. Cette technique est particulièrement bien adaptée à la production de tomates, pétunias, tabacs transgéniques, espèces qui, d’une part, sont facilement infectées par Agrobacterium et, d’autre part, produisent facilement des plantes à partir d’explants de feuilles. Les succès obtenus avec les dicotylédones ne furent pas, dans un premier temps, reproduits avec les monocotylédones, et en particulier avec les principales céréales. Cela conduisit à reconsidérer les techniques d’introduction directe d’ADN dans les protoplastes ou encore dans la lignée germinale des céréales. Par ces deux techniques, des plants de riz transgéniques mais aussi de maïs furent obtenus, laissant prévoir un succès rapide quant à la production de multiples céréales transgéniques, le principal obstacle restant actuellement non le transfert mais la régénération à partir des protoplastes. Des conditions particulières permettant l’infection de plantes monocotylédones par la bactérie du sol Agrobacterium tumefaciens furent aussi trouvées. Ainsi, si l’on dépose, au niveau de la blessure d’une plante monocotylédone, la bactérie accompagnée de substances libérées au niveau de la blessure d’une plante dicotylédone, une infection suivie d’une intégration du plasmide contenant le gène à introduire peut être obtenue.

Intérêt des plantes transgéniques

Dans le domaine de la recherche fondamentale, les plantes transgéniques fournissent un outil adapté à l’étude précise des séquences régulant l’expression des gènes, qu’il s’agisse des promoteurs, des séquences activatrices ou enhancers ou encore des séquences inhibitrices ou silencers . Pour ce faire, des gènes comportant des portions de ces séquences sont introduits, et les conséquences de leur présence ou de leur absence sur les possibilités de régulation du transgène sont étudiées. Elles permettent aussi d’observer les effets de certains gènes sur le développement des plantes en analysant les conséquences de leur surexpression ou de leur extinction. Contrairement aux difficultés rencontrées chez les souris transgéniques, l’extinction de l’expression de gènes par l’utilisation des transgènes codant pour des messagers antisens a donné de très spectaculaires résultats dans le domaine végétal. Des pétunias de couleurs variées, intermédiaires entre le rouge, correspondant à l’activité d’un gène, et le blanc, correspondant à l’absence de son expression, ont ainsi été obtenus.

Le mode d’action de certaines protéines virales peut aussi être étudié par introduction de transgènes codant pour celles-ci.

En ce qui concerne l’amélioration des espèces, c’est bien évidemment la valeur nutritive (acides aminés limitants ou vitamines) de certaines espèces qui pourrait être améliorée mais aussi leur résistance à la sécheresse ou au pourrissement. On peut aussi concevoir qu’à l’avenir puissent être obtenues des plantes capables de fixer l’azote de l’air, rendant alors inutile l’emploi des engrais azotés.

Pour ce qui est des maladies virales, l’infection par un virus est capable de conférer à une plante une certaine protection contre une infection par un virus apparenté. Bien qu’elle soit encore mal comprise, cette protection semble impliquer des protéines du manteau viral. De fait, des plantes transgéniques portant un ADNc codant pour une protéine du manteau du virus de la mosaïque du tabac ou du concombre deviennent résistantes à l’infection par les virus correspondants.

En matière de protection contre les insectes ou les mycoses, la résistance aux larves d’insectes peut être obtenue par introduction de transgènes capables de coder pour des toxines très spécifiques ou pour des inhibiteurs de protéases, enzymes capables de dégrader les protéines. L’insecte, la bactérie ou le champignon qui emploient ces protéases pour dégrader les protéines de la plante afin de les transformer en acides aminés nécessaires à leur développement voient ainsi leur approvisionnement nutritif disparaître.

Mais c’est probablement la possibilité de conférer une résistance aux herbicides qui constitue l’application le plus largement étudiée actuellement, répondant à l’utilisation massive d’herbicides très spécifiques inhibant le produit d’un gène. Ainsi, le glyphosate inhibe spécifiquement l’EPSP synthétase, enzyme nécessaire à la production d’acides aminés essentiels au développement de la plante. Si l’on introduit un transgène codant pour une EPSP synthétase ne différant que par un seul acide aminé, l’activité de l’enzyme devient beaucoup moins sensible à l’action de l’herbicide.

La production de molécules d’intérêt thérapeutique constitue enfin une voie de recherche du plus grand intérêt. Après les bactéries recombinantes, les animaux transgéniques, les plantes transgéniques devraient fournir des molécules d’intérêt thérapeutique comme l’interféron, l’insuline et bien d’autres avec des rendements très avantageux. Des colzas transgéniques deviendront ainsi bientôt de très rentables «usines pharmaceutiques».

Encyclopédie Universelle. 2012.